Тема проекта: «Разработка автономного набора для мультиплексного выявления антител к возбудителям гемотрансмиссивных инфекций (гепатитов В и С, синдрома приобретенного иммунодефицита, цитомегаловирусной инфекции, сифилиса и токсоплазмоза) в препаратах крови» (руководитель темы, зав. лабораторией иммунохимической диагностики, доктор биол. наук А.Г.Полтавченко).

Этап № 4

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от от 5 июня 2014 г. №14.607.21.0020 и Дополнительному соглашению № 1 от 25.05.2015 г. с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 4 в период с 01.01.2016 г. по 30.06.2016 г. выполнялись следующие работы, запланированные в «Плане-графике исполнения обязательств» по Соглашению:

1. Отработка технологии изготовления наборов с использованием экспериментального стенда. Разработка лабораторного технологического регламента получения наборов.
2. Изготовление экспериментальных образцов наборов.
3. Разработка программы и методик исследовательских испытаний экспериментальных образцов набора.
4. Проведение исследовательских испытаний экспериментальных образцов набора в соответствии с разработанной Программой и методиками исследовательских испытаний.
5. Поставка материалов, панелей и тест-систем для проведения испытаний экспериментальных образцов набора.
6. Материальное обеспечение экспериментов.

При этом были получены следующие результаты:

Результаты работ, выполненных (выполняемых) за счет средств субсидии.

• Отработана технология производства наборов реагентов для мультиплексного дот-иммуноанализа антител к возбудителям гемотрансмиссивных инфекций «ГТИ-спектр-IgG-антитела». Подготовлен лабораторный регламент на их производство и проект технических условий на набор.
• Изготовлены 5 серий экспериментальных образцов набора общим объемом 200 шт.
• Разработаны программы и методики лабораторных и межлабораторных исследовательских испытаний экспериментальных образцов набора.
• В соответствии с программой и методиками проведены лабораторные испытания наборов, показавшие их соответствие проекту технических условий. Расчеты на основе ускоренной оценки стабильности экспериментальных образцов набора показали, что ожидаемый срок годности набора составляет 660 дней.

Результаты работ, выполненных (выполняемых) за счет внебюджетных средств.

Обеспечены эксперименты материалами, тест-системами, образцами сывороток, заготовками матриц и аналитических ванн.
На этапе № 4 получен охраноспособный результат – Патент РФ на полезную модель «Аналитическая ванна для проведения мультиплексного дот-анализа» № 155402, приоритет от 13.04.2015.

Назначение и область применения результатов проекта.

1. Разрабатываемый диагностический набор будет применяться в медицине.
2. Внедрение разрабатываемого набора в практику позволит сделать исследование препаратов крови более простым и сократить время и стоимость комплексного анализа не менее, чем в 2 раза. Простота выполнения теста, полная комплектация и автономность набора позволят использовать такие тест-системы повсеместно.
3. Полученные в рамках проекта результаты послужат основой для создания мультиплексных иммунохимических тестов различной специфичности для нужд медицины, ветеринарии, экологии и научных экспериментов.

Эффекты от внедрения результатов проекта.

Внедрение результатов проекта позволит повысить производительность труда медицинских работников, снизить затраты на первичное тестирование препаратов крови, а также сделать серологическое обследование более оперативным.

Формы и объемы коммерциализации результатов проекта.

1. Коммерциализация полученных результатов возможна путем производства и сбыта разрабатываемых наборов, а также путем продажи лицензий на РИД другим производителям.
2. В России ежегодно при выполнении хирургических операций и донациях крови выполняется приблизительно 15 млн. первичных тестирований ГТИ (ВИЧ, гепатиты В и С, сифилис). Стоимость существующего комплексного анализа 4 маркеров в моноспецифических системах составляет около 2000 руб. Полагая, что стоимость мультиплексного анализа на 6 маркеров ГТИ составит не более 500 руб., экономическую эффективность от замены 10% существующего рынка на предлагаемые наборы можно оценить примерно в 2 млрд. руб. в год.

План работ по 4 этапу ПНИ выполнен в полном объеме. Полученные результаты исследований полностью соответствуют требованиям ТЗ и «План-графика исполнения обязательств» по Соглашению. Результаты будут использованы в дальнейших работах по проекту.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Источники информации, на основе которых подготовлен материал:

Комплект отчётной документации за этап № 4 по Соглашению от 5 июня 2014 г. № 14.607.21.0020 и Дополнительному соглашению № 1 от 25.05.2015 г., в том числе:

1. Промежуточный отчет о ПНИ «Выпуск и испытания экспериментальных образцов набора » по теме: Разработка автономного набора для мультиплексного выявления антител к возбудителям гемотрансмиссивных инфекций (гепатитов В и С, синдрома приобретенного иммунодефицита, цитомегаловирусной инфекции, сифилиса и токсоплазмоза) в препаратах крови, дата утверждения отчета 26.06.2016, 44 с., 13 табл., 2 рис., 4 источника;
2. Резюме проекта ПНИ, выполненных на отчетном этапе;
3. Аналитическая справка о выполнении проекта с приложением.

Этап № 3

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 05 июня 2014 г. № 14.607.21.0020 и Дополнительному соглашению № 1 от 25.05.2015 г. с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 3 в период с 01.07.2015 г. по 31.12.2015 г. выполнялись следующие работы, запланированные в «Плане-графике исполнения обязательств» по Соглашению:

1. Сборка и настройка экспериментального стенда для изготовления наборов с целью отработки технологии их производства.
2. Создание прототипа набора, его оценка и оптимизация.
3. Оптимизация условий применения набора.
4. Разработка компьютерной программы для инструментального учета результатов анализа.
5. Поставка материалов и комплектующих для выпуска экспериментальных образцов набора.
6. Материальное обеспечение экспериментов.

При этом были получены следующие результаты:

Результаты работ, выполненных (выполняемых) за счет средств субсидии.

Разработан, смонтирован и настроен экспериментальный стенд для изготовления наборов с целью отработки технологии их производства. Стенд представляет собой прототип производственной линии для изготовления наборов. Он размещен в трех лабораторных помещениях и оснащен необходимым оборудованием, в том числе, автоматическими устройствами, разработанными в рамках проекта. Подготовлена конструкторская документация на экспериментальный стенд в стадии эскизный проект.

Создан прототип набора «ГТИ-спектр-IgG-антитела». Набор рассчитан на выполнение 20 мультиплексных тестов и включает комплект белковых матриц, аналитические ванны и компоненты проявителя. Проведена предварительная оценка прототипа набора с применением рабочей панели сывороток, устранены выявленные недостатки.

Проведена оптимизация условий применения набора. Мультиплексный дот-иммуноанализ выполняется в аналитических ваннах в течение 70 мин при комнатной температуре и включает 12 этапов. Подготовлена инструкция по применению набора реагентов для одновременного выявления методом дот-иммуноанализа антител класса G к возбудителям гемотрансмиссивных инфекций «ГТИ-спектр-IgG-антитела».

Результаты работ, выполненных (выполняемых) за счет внебюджетных средств.

Индустриальным партнером за счет собственных средств создана компьютерная программа для учета, обработки и хранения результатов мультиплексного дот-иммуноанализа АРМ «Лаборант». Программа осуществляет анализ оцифрованного изображения матрицы, интерпретирует и выдает на печать результаты анализа, архивирует их в базе данных. Подготовлен комплект технической документации на программу.

Обеспечены эксперименты материалами, тест-системами, образцами сывороток, а так же, заготовками матриц и аналитических ванн для выпуска экспериментальных образцов набора.

На этапе № 3 получен охраноспособный результат – патент РФ на полезную модель «Аналитическая ванна для проведения мультиплексного дот-анализа» № 155402, приоритет от 13.04.2015 г.

Назначение и область применения результатов проекта.

1. Разрабатываемый диагностический набор будет применяться в медицине.
2. Внедрение разрабатываемого набора в практику позволит сделать исследование препаратов крови более простым и сократить время и стоимость комплексного анализа не менее, чем в 2 раза. Простота выполнения теста, полная комплектация и автономность набора позволят использовать такие тест-системы повсеместно.
3. Полученные в рамках проекта результаты послужат основой для создания мультиплексных иммунохимических тестов различной специфичности для нужд медицины, ветеринарии, экологии и научных экспериментов.

Внедрение результатов проекта позволит повысить производительность труда медицинских работников, снизить затраты на первичное тестирование препаратов крови, а также сделать серологическое обследование более оперативным и доступным для пациентов.

Формы и объемы коммерциализации результатов проекта.

1. Коммерциализация полученных результатов возможна путем производства и сбыта разрабатываемых наборов, а также путем продажи лицензий на РИД другим производителям.
2. В России ежегодно при выполнении хирургических операций и донациях крови выполняется приблизительно 15 млн. первичных тестирований ГТИ (ВИЧ, гепатиты В и С, сифилис). Стоимость существующего комплексного анализа 4 маркеров в моноспецифических системах составляет около 2000 руб. Полагая, что стоимость мультиплексного анализа на 6 маркеров ГТИ составит не более 500 руб., экономическую эффективность от замены 10% существующего рынка на предлагаемые наборы можно оценить примерно в 2 млрд. руб. в год.

План работ по 3 этапу ПНИ выполнен в полном объеме. Полученные результаты исследований полностью соответствуют требованиям ТЗ и «План-графика исполнения обязательств» по Соглашению. Результаты будут использованы в дальнейших работах по проекту.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Источники информации, на основе которых подготовлен материал:

Комплект отчётной документации за этап № 3 по Соглашению от 05 июня 2014 г. № 14.607.21.0020 и Дополнительному соглашению № 1 от 25.05.2015 г., в том числе:

• Промежуточный отчет о ПНИ «Создание прототипа набора и способа его применения» по теме: Разработка автономного набора для мультиплексного выявления антител к возбудителям гемотрансмиссивных инфекций (гепатитов В и С, синдрома приобретенного иммунодефицита, цитомегаловирусной инфекции, сифилиса и токсоплазмоза) в препаратах крови;
• Резюме проекта ПНИ, выполненных на отчетном этапе;
• Аналитическая справка о выполнении проекта с приложением.

Этап № 2

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от от 05 июня 2014 г. № 14.607.21.0020 и Дополнительному соглашению № 1 от 25.05.2015 г. с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 2 в период с 01.01.2015 г. по 30.06.2015 г. выполнялись следующие работы, запланированные в «Плане-графике исполнения обязательств» по Соглашению:

1. Разработка и изготовление нестандартного устройства для автоматического нанесения иммунореагентов на подложку матрицы.
2. Подбор наиболее эффективных антигенов и условий их иммобилизации.
3. Подбор наиболее эффективных вторичных иммунокомпонентов и оптимизация способа получения коньюгатов на основе коллоидного золота.
4. Оптимизация условий проявления результатов анализа.
5. Разработка и изготовление рабочих панелей положительных и отрицательных сывороток по номенклатуре иммуночипа.
6. Обеспечение экспериментов подложками, ваннами и расходными материалами. 2.7. Материальное обеспечение экспериментов.

При этом были получены следующие результаты:

Результаты работ, выполненных (выполняемых) за счет средств субсидии.

• Разработано и изготовлено автоматизированное устройство, позволяющее наносить антигены на подложку белкового чипа с производительностью 50 чипов в мин.
• Подобраны наиболее перспективные антигены возбудителей гемотрансмиссивных инфекций и индивидуальные условия их иммобилизации на подложке иммуночипа.
• Установлено, что повышение стабильности конъюгатов на основе коллоидного золота может быть достигнуто удалением агрегированных частиц из конечного продукта.
• Оптимизирован состав проявителя, включающий жидкий компонент – раствор AgNO3 и тритурационные таблетки сухой смеси метола и лимонной кислоты.

Результаты работ, выполненных (выполняемых) за счет внебюджетных средств.

• Индустриальным партнером за счет собственных средств создана рабочая панель из 24 сывороток, содержащих маркеры гемотрансмиссивных инфекций в разных сочетаниях и концентрациях.
• Обеспечены эксперименты материалами, тест-системами, образцами сывороток, заготовками матриц и аналитических ванн.

На этапе № 2 получен охраноспособный результат. Подана Заявка на полезную модель «Аналитическая ванна для проведения мультиплексного дот-анализа» № 2015113598 от 13.04.2015 г.

Назначение и область применения результатов проекта.

1. Разрабатываемый диагностический набор будет применяться в медицине.
2. Внедрение разрабатываемого набора в практику позволит сделать исследование препаратов крови более простым и сократить время и стоимость комплексного анализа не менее, чем в 2 раза. Простота выполнения теста, полная комплектация и автономность набора позволят использовать такие тест-системы повсеместно.
3. Полученные в рамках проекта результаты послужат основой для создания мультиплексных иммунохимических тестов различной специфичности для нужд медицины, ветеринарии, экологии и научных экспериментов.

Внедрение результатов проекта позволит повысить производительность труда медицинских работников, снизить затраты на первичное тестирование препаратов крови, а также сделать серологическое обследование более оперативным и доступным для пациентов.

Формы и объемы коммерциализации результатов проекта.

1. Коммерциализация полученных результатов возможна путем производства и сбыта разрабатываемых наборов, а также путем продажи лицензий на РИД другим производителям.
2. В России ежегодно при выполнении хирургических операций и донациях крови выполняется приблизительно 15 млн. первичных тестирований ГТИ (ВИЧ, гепатиты В и С, сифилис). Стоимость существующего комплексного анализа 4 маркеров в моноспецифических системах составляет около 2000 руб. Полагая, что стоимость мультиплексного анализа на 6 маркеров ГТИ составит не более 500 руб., экономическую эффективность от замены 10% существующего рынка на предлагаемые наборы можно оценить примерно в 2 млрд. руб. в год.

План работ по 2 этапу ПНИ выполнен в полном объеме. Полученные результаты исследований полностью соответствуют требованиям ТЗ и «План-графика исполнения обязательств» по Соглашению. Результаты будут использованы в дальнейших работах по проекту.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

Этап № 1

В ходе выполнения проекта по этапе № 1 «Выбор и обоснование направлений исследования, экспериментальная оценка материалов подложки» в период с 05.06.14 г. по 31.12.14 г. выполнялись следующие работы:

1. Работы, выполненные за счет средств субсидии:

• Анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к разрабатываемой теме.
• Проведение патентных исследований по ГОСТ 15.011-96.
• Исследование целевых свойств новых материалов для изготовления подложки.
• Отработка способов предварительной подготовки материала для изготовления подложек и выкройки матриц.
• Разработка и изготовление нестандартного устройства для автоматического заполнения растворами ячеек аналитических ванн.

2. Работы (мероприятия), выполненные за счет внебюджетных средств:

• Подготовка технических заданий на разработку нестандартного оборудования для экспериментального стенда.
• Обеспечение экспериментов материалами, тест-системами, образцами сывороток, заготовками матриц и аналитических ванн.
• Материальное обеспечение экспериментов.

При этом были получены следующие результаты:

По п. 1.1 подготовлен обзор литературы «Подходы к обеспечению эффективного первичного тестирования гемотрансмиссивных инфекций». Объем обзора 84 стр., цитируемый список включает 231 источник, из которых 170 зарубежных, в том числе 60 источников, опубликованных за последние 5 лет. В обзоре приведены данные о заболеваемости гемотрансмиссивными инфекциями (ГТИ), путях их передачи и распространения, даны характеристики наиболее актуальных возбудителей ГТИ и их серологических маркеров. Описана существующая система диагностики и скрининга ГТИ в препаратах крови. Обоснована актуальность создания простого в исполнении, автономного и оперативного теста для первичного скрининга ГТИ у доноров и в группах риска населения. Приведены характеристики существующих форматов мультиплексных систем для иммунохимического анализа, описаны методические приемы, используемые при создании мультиплексных тестов. Обоснован выбор для разработки формата плоских белковых матриц и хромогенной системы детекции. Определены наиболее перспективные серологические маркеры ГТИ.

По п. 1.2 проведены патентные исследования по ГОСТ 15.011-96 по теме разработки. Подготовлен отчет о патентных исследованиях.

По п. 1.3 выполнены эксперименты по исследованию целевых свойств новых материалов для изготовления подложки белковых матриц. Исследовано 10 доступных на российском рынке образцов белой, матовой синтетической бумаги на основе полипропилена и поливинилхлорида. Оценена структура поверхности (с использованием световой, сканирующей электронной и атомно-силовой микроскопии), эффективность адсорбции нескольких различных белков, а также совместимость материала с компонентами системы иммунологического анализа и фоновые явления в процессе его выполнения. Установлено, что исследованные материалы значительно различаются по структуре поверхности, сорбционным свойствам и способности провоцировать фоновые сигналы. Фоновые оптические сигналы более заметно проявляются на поверхностях с грубой структурой и, вероятно, связаны с механической задержкой наночастиц золота из конъюгата в неровностях рельефа. Выявлена зависимость эффективности адсорбции белков от равномерности структуры поверхности синтетической бумаги, содержания в ней двуокиси титана и обработки материала коронным разрядом. Органическая составляющая синтетической бумаги оказывает менее заметное влияние на адсорбционные характеристики поверхности. Сделан вывод о том, что из исследованных доступных материалов наиболее пригодной для изготовления подложек белковых матриц является синтетическая бумага «Pentaprint» марки PR-M480/09-07/8101-482D8. Этот материал будет использован в дальнейших работах по проекту.

По п. 1.4 проведена экспериментальная оценка способов выкройки заготовок матриц из листового материала: вырезки при помощи режущего плоттера, фрезерной вырезки, выкройки при помощи лазерного гравера и механической вырубки при помощи типографского пресса. Поиск и оценку наиболее эффективных вариантов реализации этих методов выполняли с использованием оборудования и привлечением специалистов профильных организаций. Методы плоттерной и фрезерной выкройки признаны неперспективными, поскольку показали малую производительность и низкое качество конечного продукта. Лазерная вырезка сопровождалась выбросом продуктов горения, вызывающих стойкие загрязнения заготовок матриц и мешающих выполнению иммунохимического анализа. Путем подбора характеристик шаблона и режимов управления лазером найден вариант выкройки, исключающий загрязнение рабочей стороны матриц и позволяющий вырезать 100 заготовок из листа (формата А3) бумаги на основе пропилена за 3-4 минуты. Однако, для бумаги на основе ПВХ лазерная резка не пригодна, поскольку сопровождается выбросом токсичных продуктов, обладающих высоким коррозирующим действием на элементы оборудования. Механическая вырубка при помощи типографского пресса оказалась эффективной при одновременной высечке до 20 заготовок и оптимальной по скорости изготовления большого количества однотипных деталей. Разработан шаблон, учитывающий изменения размеров заготовок в процессе вырубки, и по нему изготовлена штанцевальная форма. Отработанные приемы вырубки заготовок матриц пригодны для изготовления подложек как из бумаги на основе полипропилена, так и из ПВХ пластиков и отвечают требованиям технологичности, чистоты материала и цены.

Проведены эксперименты по оценке способов отмывки заготовок матриц перед иммобилизацией антигенов. Предложены 2 метода подготовки поверхности:

1. Механическая отмывка с применением губки в 0,2%-м теплом (40°С) растворе детергента 7-Х с последующей промывкой заготовок в двух сменах дистиллированной воды и сушкой на воздухе – предназначена для отмывки цельных листов и полос с заготовками матриц, вырубленных типографским прессом.
2. Отмывка в трех сменах дистиллированной воды (по 10 мин) в ультразвуковой ванне и сушкой на воздухе – для листов формата А3, раскроенных лазером. Оба способа обеспечивают сходную эффективность сорбции белков как на поверхности полипропиленовой бумаги «Polylith» марки GН-1, так и на поверхности ПВХ пластика «Pentaprint» марки PR-M480/09-07/8101-482D8.

Подготовлен промежуточный отчет о результатах ПНИ по этапу 1.

По п. 1.5 разработано и изготовлено нестандартное устройство для автоматического заполнения растворами ячеек аналитических ванн. Устройство обеспечивает автоматическое позиционирование и заполнение ванн растворами с одновременной работой от 0 до 14 дозаторов, позволяющих дифференцированно подавать в ячейки ванны растворы в объеме от 0,1 до 1,5 мл с погрешностью не более 10%. Производительность устройства 5 рядов ячеек (1 ванна) в мин.

Подготовлена конструкторская документация (КД) в стадии эскизный проект к устройству для автоматического заполнения аналитических ванн в составе: пояснительная записка к эскизному проекту 95450697.452680.014.П1, ведомость эскизного проекта 95450697.452680.014.ЭП, чертеж общего вида 95450697.452680.014.В0, паспорт устройства для заполнения аналитических ванн 95450697.452680.014.ПС, руководство пользователя 95450697.452680.014.И3, лист утверждения КД 95450697.452680.014-ЛУ. Произведена приемка устройства с испытанием его основных технических характеристик.

По п. 2.1 за счет средств индустриального партнера в соответствии с ГОСТ 34.602-89 подготовлены технические задания (ТЗ) на разработку нестандартного оборудования для экспериментального стенда:

1. ТЗ на разработку устройства для нанесения антигенов на подложку,
2. ТЗ на разработку устройства для заполнения аналитических ванн.

По п. 2.2 за счет средств индустриального партнера эксперименты обеспечены необходимым количеством тест-систем, заготовок матриц и аналитических ванн. По п. 2.3 за счет собственных средств исполнителя проекта эксперименты обеспечены необходимыми материалами и оборудованием.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.