Этап № 5

На этапе № 5 (01.07.2016 г. – 31.12.2016 г.) выполнения работ проекта были получены следующие результаты:

1. Выполнены доводочные испытания свойств и условий применения экспериментального образца тест-системы «EpiGene CRC» для диагностики колоректального рака на основе GLAD-ПЦР-анализа.
2. Разработаны проект технических условий (ТУ) на тест-систему «EpiGene CRC» и инструкция по применению.
3. Разработаны рекомендации и предложения по использованию результатов ПНИ в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках.
4. Разработан проект ТЗ на ОКР по разработке промышленной технологии производства и выпуска опытных партий эпигенетической тест-системы для диагностики колоректального рака на ранних стадиях методом GLAD-ПЦР-анализа.

На 5 этапе подготовлена следующая отчетная документация: заключительный отчет о ПНИ, протокол доводочных испытаний тест-системы, проект ТУ на набор реагентов, проект инструкции по применению тест-системы, рекомендации и предложения по использованию результатов ПНИ, проект ТЗ на ОКР.

Индустриальным партнером за счет собственных средств на 5 этапе проведены испытания экспериментального образца тест-системы в производственных условиях в соответствии с Программой и методиками исследовательских испытаний, подготовлено технико-экономическое обоснование разработки тест-системы для диагностики колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа с учетом технологических возможностей индустриального партнера, проведена оценка РИД, полученных при выполнении проекта.

Участие в мероприятиях, направленных на освещение и популяризацию промежуточных и окончательных результатов проекта на 5 этапе:

• Выставка «MEDICA-2016. World Forum for Medicine». Дюссельдорф, Германия, 14-17 ноября 2016 г.;
• Конгресс «43th ISOBM Annual Congress of International Society of Oncology and BioMarkers 2016», Chicago, Illinois, USA, 1-6 сентября 2016 г.;
• Конференция «OpenBio-2016», Россия, Кольцово (Новосибирская обл.), 5-6 октября 2016 г.;
• III Ежегодная Всероссийская научно-практическая конференция «Исследования и разработки-2016», Россия, г.Москва, 14-15 декабря 2016 г.

На этапе № 5 опубликованы 3 статьи в научных журналах и получен охраноспособный результат – подана заявка на патент РФ «Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа и набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для осуществления указанного способа».

Все задачи 5 этапа ПНИ решены в полном объёме и в согласованные с Заказчиком сроки в соответствии с техническим заданием и планом-графиком исполнения работ.

Этап № 4

На этапе № 4 выполнения работ проекта в период с 01.01.2016 г. по 30.06.2016 г. были получены следующие результаты:

1. Завершено формирование коллекции образцов биологического материала, полученного из периферической крови различных групп больных КРР и здоровых доноров.
2. Проведены исследовательские испытания экспериментального образца тест-системы в соответствии с Программой и методиками исследовательских испытаний, в том числе:
   • Верификация сигнатур для эпигенетической диагностики колоректального рака на препаратах ДНК не менее 200 пациентов с подтвержденным диагнозом и не менее 200 здоровых доноров.
   • Оценка чувствительности и специфичности сигнатур. Протоколы испытаний приложены в составе отчетной документации по 4 этапу.

Индустриальным партнером за счет собственных средств на 4 этапе проведены маркетинговые исследования с целью изучения перспектив коммерциализации РИД, полученных при выполнении проекта, а также изготовлены высокоочищенные и высококонцентрированные препараты ферментов, входящих в состав тест-системы.

На этапе № 4 опубликована научная статья «Применение метода GLAD-ПЦР анализа для выявления сайтов метилирования в регуляторных областях генов-онкосупрессоров ELMO1 и ESR1 при колоректальном раке». Вопросы онкологии. 2016. Т.62. № 1. С.117-121.

Все задачи 4 этапа ПНИ решены в полном объёме и в согласованные с Заказчиком сроки в соответствии с техническим заданием и планом-графиком исполнения работ. Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на 4 этапе исполненными надлежащим образом.

Этап № 3

На этапе № 3 выполнения работ проекта в период с 01.07.2015 г. по 31.12.2015 г. были получены следующие результаты:

1. Сформирована сигнатура для диагностики колоректального рака на базе 5 эпигенетических онкомаркеров. Маркерные сайты RCGY, включенные в сигнатуру эпигенетической тест-системы для диагностики колоректального рака, относятся к 5 разным генам, ассоциированным с колоректальным раком. Для каждого сайта выбраны последовательности геномного праймера, флуоресцентного зонда и гибридного праймера.
2. Дополнена формируемая с начала проекта коллекция образцов биологического материала, полученного из периферической крови различных групп больных КРР и здоровых доноров.
3. Разработана технология получения тест-системы для диагностики колоректального рака на основе GLAD-ПЦР-анализа и оформлен лабораторный регламент получения тест-системы.
4. Разработана эскизная конструкторская документация на экспериментальный образец тест-системы.
5. Изготовлен экспериментальный образец тест-системы «EpiGene CRC» для диагностики колоректального рака на основе GLAD-ПЦР-анализа.
6. Разработаны программа и методики исследовательских испытаний экспериментального образца тест-системы.

Индустриальным партнером за счет собственных средств на 3 этапе проведен синтез олигонуклеотидных адаптеров и TaqMan-зондов для тест-системы, произведены в необходимом объеме реакционные буферы для рестриктаз, полимераз, лигаз, входящих в состав тест-системы.

На этапе № 3 получены охраноспособные результаты – поданы 2 заявки на патенты РФ: «Способ определения нуклеотидной последовательности R(5mC)GY в заданном положении протяженной ДНК» и «Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регуляторных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа и олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые зонды для осуществления указанного способа».

Участие в мероприятиях, направленных на освещение и популяризацию промежуточных и окончательных результатов проекта на 3 этапе:

• Конференция «GlobalCancerSummit 2015», Индия, г.Бангалор, 8-20 ноября 2015 г.;
• Выставка «Medica-2015», Германия, г. Дюссельфорф, 16-19 ноября 2015 г.;
• Конференция «Novel Cancer Therapeutics Summit 2015», США, San Francisco, 16-17 ноября 2015 г.;
• Конференция «OpenBio-2015», Россия, Кольцово (Новосибирская обл.), 1-2 декабря 2015 г.;
• Научно-практическая конференция по итогам реализации в 2015 году прикладных научных исследований и экспериментальных разработок по приоритетным направлениям в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» (ВУЗПРОМЭКСПО-2015). Россия, г.Москва, 1-4 декабря 2015 г.;
• Научная конференция с представителями сектора исследований и разработок, коммерческого сектора, высшего профессионального образования Сибирского федерального округа в рамках участия в 2015 году в реализации федеральных целевых программ и внепрограммных мероприятий, заказчиком которых является Минобрнауки России. Россия, г.Кемерово, 1-2 декабря 2015 г.

Все задачи 3 этапа ПНИ решены в полном объёме и в согласованные с Заказчиком сроки в соответствии с техническим заданием и планом-графиком исполнения работ. Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на 3 этапе исполненными надлежащим образом.

Этап № 2

На этапе № 2 выполнения работ проекта в период с 01.01.2015 г. по 30.06.2015 г. были получены следующие результаты:

1) Подобраны все компоненты набора реагентов для выделения ДНК, пригодной для GLAD-ПЦР-анализа, из образцов биологического материала.

2) Создана коллекция образцов биологического материала, полученного из плазмы периферической крови различных групп больных и здоровых доноров. В коллекции также содержатся образцы ДНК, выделенной из смывов с клеток крови, а также образцы ДНК, выделенной из тканей оперированных больных с диагнозом «колоректальный рак».

На настоящий момент в коллекцию входит:

• 113 образцов ДНК, больных c диагнозом «колоректальный рак».
• 113 образцов ДНК здоровых доноров.
• 15 образцов ДНК из опухолевых тканей больных с диагнозом «колоректальный рак».

Коллекция хранится в низкотемпературном холодильнике отдела при температуре минус 60°С. Все образцы имеют специфическую маркировку.

При создании коллекции разработаны следующие обязательные документы:

• Карта учёта поступления биологического материала (кровь).
• Карта учёта поступления биологического материала (опухолевая ткань).
• Информированное согласие участника исследования.
• Индивидуальная регистрационная карта пациента, участвующего в научном исследовании.

Коллекция будет пополняться на последующих этапах выполнения работ.

3) Разработана методика выделения ДНК, пригодной для GLAD-ПЦР-анализа, из образцов биологического материала, учитывающая требования по стандартизации составов используемых реакционных смесей и условий выделения ДНК, доступность используемых реагентов и требования по воспроизводимости результатов при условии соблюдения всех параметров реакции, качества используемых реагентов и правил организации работ.

Методика создана на основе разработанного в данном проекте метода выделения ДНК, связанной с клетками крови, позволяющего в течение 1 дня провести выделение и получить высокоочищенный препарат ДНК, пригодный для GLAD-ПЦР-анализа.

4) Разработаны специфичные праймеры, олигонуклеотидные адаптеры и TaqMan-зонды для тест-системы:

• Специфичные праймеры: SEPT9b_s, SEPT9b_a, FBN559ih, Fbn1(2), RUNX964ih, RUNX3, GATA4_1_173, GATA4_1_299ih, SND1089ih, Snd1, ADHFE504ih, Adhfe568, TLX2_193ih, Tlx2_106, ITGA4_648ih, ITGA536, CNRIP206ih, CNRIP266, RYR1165ih, RYR1234, SOCS3_829ih, SOCS3_899, FLI396ih, FLI518, Uchl1-1, Uchl1-68, ELMO1_877ih, ELMO945, ESR1_148ih, ESR1_211.
• Олигонуклеотидные адаптеры: «адаптер2» и «адаптер2к».
• TaqMan-зонды: SEPT9bz, Fbn1Z, RUNX3Z, GATA4_1_227z, Snd1Z, Adhfe1Z, TLX2_144_z, ITGA555z, CNRIP245z, RYR1197z, SOCS3_874z, FLI491z, UCHL1_41z, ELMO914z, ESR1_184z.

5) Проведен скрининг выбранных эпигенетических онкомаркеров на наличие метилирования, коррелирующего с колоректальным раком. Наиболее перспективными оказались гены RYR2, CNRIP1, ESR1, FBN1, SOCS3 и UCHL1, выявившие от 80 до 100% исследованных образцов колоректального рака. В дальнейшем, в ходе анализа большего количества опухолевых образцов разного генеза, предполагается, что данный список генов будет уточняться и/или дополняться.

Все задачи 2 этапа ПНИ решены в полном объёме и в согласованные контрактом сроки в соответствии с техническим заданием и планом-графиком исполнения обязательств.

Этап № 1

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 05.08.2014 г. № 14.604.21.0102 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 1 в период с 05.08.2014 г. по 31.12.2014 г. выполнялись следующие работы:

1. Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ.
2. Проведение патентных исследований по ГОСТ 15.011-96.
3. Проведение сравнительной оценки эффективности возможных направлений исследований.
4. Разработка перечня эпигенетических онкомаркеров колоректального рака для анализа в образцах клинического материала и формирования сигнатур.
5. Подбор и оценка качества ферментных препаратов для разработки тест-системы.
6. Разработка методики определения чистоты ДНК-эндонуклеаз.
7. Исследование влияния способов забора крови и вариантов предварительной обработки образцов биологического материала на определение метилирования ДНК.
8. Разработка методики забора и предварительной обработки биологических образцов.

При этом были получены следующие результаты:

1. Разработан перечень эпигенетических онкомаркеров, включающий 15 регуляторных участков генов (SEPT9, CNRIP1, TLX2, SOCS3, RUNX3, SND1, UCHL1, ELMO1, ESR1, FLI1, RYR2, ITGA4, ADHFE1, GATA4, FBN1), часто подвергающихся гиперметилированию при колоректальном раке.

2. Установлено, что применение вакуум-содержащих систем с антикоагулирующие веществами и использование процедуры смыва связанных с клеточными поверхностями нуклеиновых кислот приводит к 2-5-кратному увеличению выхода ДНК по сравнению с обычным способом выделения ДНК из плазмы крови.

3. Разработана методика забора и предварительной обработки биологических образцов. В настоящей работе впервые применен новый запатентованный метод GLAD-ПЦР анализа для диагностики онкологических заболеваний. Внедрение этого метода позволит увеличить чувствительность диагностики, сократить время анализа и снизить его стоимость, что, несомненно, будет способствовать увеличению доли эпигенетического тестирования в общей структуре лабораторной онкодиагностики.

Полученные результаты полностью соответствуют требованиям ТЗ и позволяют продолжить выполнение проекта согласно календарному плану. В результате достижения целей НИР можно будет создать эпигенетическую тест-систему для ранней онкодиагностики. Дальнейшее развитие проекта предусматривает создание готовой тест-системы для использования в клинической и лабораторной практике с прогнозируемой потребностью рынка не менее 1 000 000 исследований в год.

Основным потенциальным потребителем научного результата являются производители диагностикумов. Наряду с этим, результаты работы по проекту могут быть использованы подразделениями научно-исследовательских институтов, занимающимися вопросами эпигенетики заболеваний.

Потенциальными потребителями конечных тест-систем выступают специализированые онкоцентры, а также диагностические лаборатории и диагностические центры общего профиля, как государственные, так и частные.

Промежуточные результаты работы были представлены на научно-практической конференции «Реализация прикладных научных исследований и экспериментальных разработок по приоритетному направлению Науки о жизни» в 2014 году в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», Россия, Москва, 1-2 декабря 2014 г. (организаторы конференции: Министерство образования и науки РФ; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук). Информационные материалы о Конференции размещены на http://xpir.fcntp.ru/activities/8a2733a61fd142f6ae3be5991ba6c46c.